科研丨北大人民医院： 肌炎患者肠道微生物组特征的宏基因组关联研究(国人佳作)

  科研丨北大人民医院: 肌炎患者肠道微生物组特征的宏基因组关联研究(国人佳作)

  本研究是第一项通过MWAS调查肠道微生物组在肌炎或肌炎相关ILD中的作用的研究。

  本研究分析了30名肌炎患者和31名健康受试者的肠道菌落宏基因组。首先选择平均相对丰度1*10−3的细菌做多元化的分析，包括9门、19纲、29目、58科、145属和398种。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)表明，从β多样性的角度来看，肌炎病例和HC之间的细菌存在非常明显差异(adonis P=0.001，图1A)。为了确定肌炎肠道微生物组的菌群特征，随后比较了肌炎和HC中细菌的总体分布(图1B)。在门水平上，与HC组相比，肌炎组最丰富的门是拟杆菌门，厚壁菌门显著减少，变形菌门明显地增加。进一步绘制了差异火山图，发现在种水平上，与HC相比，肌炎患者的Alistipes onderdonkii、Parabacteroides distasonis和大肠杆菌(Escherichia coli)上调，Lachnospiraceaebacterium GAM79、Roseburia intestinalis和嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)下调，这些均对应于上述门。本研究还发现，大多数肌炎患者中富集的进化枝属于L. paracasei和E. avium。详细结果如图1C所示。

  (A)基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)。用种水平的细菌组成评估距离矩阵。采用Adonis检验以比较β多样性的显著性。(B)肌炎患者和HC中细菌总体分布水平的分析，列举前10名。使用Pavian宏基因组数据浏览器(的在线服务器进行可视化。(C)进化枝MWAS结果的火山图。x轴表示log2 Fold Change值。y轴表示观察到的−log10 FDR值。Fold Change值2且FDR值0.01的进化枝被视为富集。HC：健康对照。

  基于MetaCyc数据库，使用HUMAnN2进一步确定了可能与肌炎发病有关的宏基因组生物学通路(图2A)。通过该分析，微生物在这些通路中的贡献由富集在各种生物通路的细菌基因做评估。根据结果得出，在参与dTDP-N-acetylthiosulfonamide生物合成的基因中，来自大肠杆菌的基因相对丰度最高(PWY-7315)，这表明大肠杆菌可能在dTDP-N-acetylthiosulfonamide生物合成通路中发挥及其重要的作用(图2B)。也有其他细菌与dTDP-N-acetylthiosulfonamide生物合成相关，如Salmonella enterica和Citrobacter freundii，但它们不是主要贡献者(图2B)。此外，在L-色氨酸生物合成(PWY-6629)、NAD生物合成I(来自天冬氨酸)(PYRIDNUCSYN-PWY)和L-精氨酸生物合成IV(古细菌)(PWY-7400)中，我们得知大肠杆菌的贡献也是最大的。这些根据结果得出，肠道大肠杆菌可能参与了肌炎的发病机制。详细结果见补充表3。

  (A)基于MetaCyc数据库，使用HUMAnN2鉴定宏基因组生物学通路。蓝条显示相对的倍数变化值(肌炎vs. HC)，红线显示-logFDR值。(B)细菌在特定生物通路中的贡献(dTDP-N-acetylthomosamine生物合成)。(C)、(D)临床参数(并发症，C；免疫指数，D)与细菌β/α多样性之间的关联分析。柱状图表示临床指标与细菌β多样性相关性的R平方值，pheatmap表示临床指标与α多样性(Shannon-wiener多样性指数和Chao1、丰富度估计值)之间的Spearman相关性。HC：健康对照；MY：肌炎；OS：总生存期；ANA：抗核抗体；TIF-1γ：翻译起始因子-1γ；MDA5：黑色素瘤分化相关基因5；NXP2：核基质蛋白2；；SAE：小泛素样修饰酶；PM/Scl：多发性肌炎/硬皮病；RF：类风湿因子；AST：天冬氨酸氨转氨酶；LDH：乳酸脱氢酶：CK：肌酸激酶；ESR：红细胞沉降率；CRP：C反应蛋白；NK：自然杀伤细胞；Treg：调节性T细胞；Teff：效应T细胞。

  抗PL-12抗体、抗Ro-52抗体或抗EJ抗体的存在与细菌多样性降低(Shannon-wiener多样性指数和Chao1丰富度估计值)显著相关，而抗PL-7抗体、抗SAE抗体和年龄与细菌多样性呈正相关(图2C-D)。作者比较了该肌炎队列中ASS患者和皮肌炎(DM)患者的肠道微生物群，以分析两者间的差异。β多样性分析显示，ASS患者和DM患者之间的肠道微生物组没有显著差异(补充图3)。R平方值越大则表示相关性越好，肌无力和RF与细菌多样性的相关性高于其他临床特征(图2C-D)。这一些数据揭示了肌炎患者和HC之间肠道微生物组和相关宏基因组生物学通路的显著差异，这可能与肌炎的发病机制有关。

  间质性肺病(ILD)是肌炎的重要并发症，可分为快速进展性ILD(RP-ILD)和慢性ILD(C-ILD)。RP-ILD是肌炎最致命的并发症。为了探讨肌炎患者肠道菌群失调与ILD发展之间的关联，将肌炎病例分为三组：RP-ILD、C-ILD和Non-ILD。β多样性分析显示，RP-ILD组和C-ILD组之间的微生物群多样性存在差异(adonis P=0.029，图3A)，但ILD患者与Non-ILD患者之间没有显著差异(补充图4)。

  为了比较RP-ILD组和C-ILD组的微生物特征，还分析了细菌的整体分布水平，结果如图3B所示。在物种水平上，作者发现RP-ILD组拟杆菌门和厚壁菌门菌群数量显著减少，而变形菌门菌群数量显著增加。随后本研究展示了火山图，并注释了每组的前五个富集群落。与C-ILD病例相比，RP-ILD患者中多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、P. distasonis和大肠杆菌上调，Bacteroides A1C1和Bacteroides xylanisolvens下调。根据结果得出，RP-ILD富集的大多数进化枝属于E. aviu、E. sp. DA9等。详细结果如图3C所示。

  (A)基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)。用种水平的细菌组成评估距离矩阵。采用Adonis检验比较β多样性的显著性。(B) RP-ILD和C-ILD中细菌的总体分布水平分析，列举出前10名。使用Pavian宏基因组数据浏览器的在线服务器进行可视化。(C)进化枝MWAS结果的火山图。x轴表示log2 Fold Change值。y轴表示观察到的−log10 FDR值。Fold Change值2且FDR值0.01的进化枝被视为富集。RP-ILD：快速进展性间质性肺疾病；C-ILD：慢性间质性肺疾病。

  使用基于MetaCyc数据库的HUMAnN2进行功能分析，以确定与RP-ILD相关的宏基因组生物学通路(图4A)。通过一系列分析发现富集的通路有4-甲基儿茶酚降解、儿茶酚降解、芳香族化合物降解、脂肪酸β-氧化V、甲基膦酸酯降解I等。此外还评估了微生物在这些通路中的贡献。HUMAnN2分析表明大肠杆菌对甲基膦酸酯降解I、dTDP-N-acetylthiosulfonamide生物合成、淀粉降解V等途径富集的基因贡献最大，这在某种程度上预示着大肠杆菌可能在甲基膦酸酯降解I(图4B)、dTDP-N-acetylthiosulfonamide生物合成(图4C)和淀粉降解V(图4d)通路中发挥极大作用。这一些数据揭示了RP-ILD肌炎患者和C-ILD肌炎患者肠道微生物组和宏基因组生物学通路的显著差异，表明差异肠道微生物组可能参与肌炎中RP-ILD的发展。

  (A)基于MetaCyc数据库，通过HUMAnN2鉴定宏基因组生物学通路。蓝条显示相对倍数变化值(RP-ILD与C-ILD)，红线表示-logFDR值。细菌在特定生物学通路中的贡献：甲基膦酸酯降解I(B)、dTDP-N-acetylthomosamine生物合成(C)、淀粉降解V(D)。RP-ILD：快速进展性间质性肺疾病；C-ILD：慢性间质性肺疾病。

  (A)肌炎组vs.对照组；(B)RP-ILD组 vs. C-ILD组。ROC：受试者工作特征曲线。RP-ILD：快速进展性间质性肺疾病；C-ILD：慢性间质性肺疾病。

  鉴于本研究的样本量有限，有几率存在样本选择偏倚，从而潜在地影响研究结果。为了验证我们的研究，下载了有关数据作为本研究结论的外部验证。迄今为止，尚无通过全基因组鸟枪测序产生的肌炎患者的肠道微生物组数据。目前已发表的通过16S rDNA测序研究肌炎微生物组的报道有三篇，其中两项研究的数据可从公共数据库(CRA004577和PRJNA734725)获得。在门水平上，本研究的结果与外部验证基本一致。分析表明，在门水平上，肌炎组中拟杆菌门和变形菌门的丰度高于健康个体，而疣微菌门和厚壁菌门的丰度低于健康个体，这与本研究的结果一致。然而，两个外部数据集中放线菌门的变化是不同的，我们没办法将其作比较(图1B，补充图5和补充表4)。在属水平上，外部数据和我们的研究也观察到了类似的结果。肌炎组中Parabacteroides(拟杆菌门)和阿克曼氏菌属(疣微菌门)的比例高于健康组，而普雷沃氏菌属(拟杆菌门)、Lachnoclostridium(厚壁菌门)、Ruminiclostridium(厚壁菌门)比例低于健康组。然而，我们的研究与外部数据任旧存在一些差异。肌炎组中Enterobacteria(变形菌门)比例增加，而其在外部数据集中下降(图1B，补充图5A-B和补充表4)。总体而言，本研究的结果与外部研究基本一致。 此外，已发表的外部数据集中未报告肌炎患者C-ILD和RP-ILD亚组的比较。因此，我们没办法对本研究之后发现的肌炎患者C-ILD和RP-ILD亚组微生物组的差异进行外部验证。

  肌炎是一组以肌肉炎症为特征的异质性自身免疫性疾病。通过对肌炎病例-对照队列的肠道微生物群做综合MWAS分析，本研究提出了肠道微生物组与肌炎或肌炎相关ILD间的联系，并发现了受与该疾病相关的肠道微生物群影响的信号通路。在肌炎和HC的比较中，A. onderdonkii、P. distasonis和E. coli在肌炎组中上调，L. bacterium GAM79、R. intestinalis和A. muciniphila在HC中下调。ROC分析还表明，E. coli和R. intestinalis联合模型在肌炎组与HC组间拥有非常良好的诊断价值。单独使用R. intestinalis可以区分RP-ILD肌炎患者和C-ILD肌炎患者。 既往研究表明A. onderdonkii似乎是一种益生菌，其减少可通过减少短链脂肪酸的产生进而促进非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者的晚期纤维化。然而，本研究之后发现A. onderdonkii是肌炎组中常见的物种，这表明A. onderdonkii可能参与肌炎的疾病发展。最近有报道证明，P. distasonis能改善宿主葡萄糖和脂质代谢紊乱，而一项研究报告糖酵解必需的基因在肌炎中受到抑制。本研究结果为，P. distasonis在肌炎组中上调，并伴有葡萄糖和脂质代谢等宏基因组生物学通路的高表达，如糖酵解I(来自葡萄糖6-磷酸)、脂肪酸和β氧化I等。之前的一项研究报道称，P. distasonis可以缓解ob/ob和高脂饮食(HFD)喂养小鼠的肥胖和代谢功能障碍。根据本研究的结果，作者推测P. distasonis可能发挥复杂的作用，在不同的疾病背景条件下具有不一样的功能，并且在肌炎中可能具有致病性。一些研究表明，与对照组相比，Toll样受体(TLR)-4和TLR3(两种有效的自噬诱导因子)在肌炎中高表达。大肠杆菌通过其细菌性淀粉样蛋白卷曲，可通过TLRs(包括TLRs 1/2、4和9)和炎性小体触发先天免疫，从而对遗传上易患肌炎的个体构成潜在的免疫触发。此外，卷曲淀粉样蛋白与细菌胞外DNA(eDNA)天然结合，使大肠杆菌激活树突状细胞和巨噬细胞，产生大量促炎因子，并可触发I型IFNs的产生。富集的大肠杆菌可能作为肌炎病原性免疫反应的触发因素。 在本研究中，与肌炎组相比，HC中A. muciniphila和R. intestinalisis均上调，据报道这两种细菌都是很有前景的益生菌。粘蛋白通过保护气道和肠道表面上皮参与粘膜免疫防御。粘蛋白分泌增加可能干扰上皮的正常修复过程，也可能具有毒性并刺激纤维增生反应，导致肌炎和ILD。由于A. muciniphila可降解粘蛋白以缓解炎症性肠病(IBD)，因此它可能在肌炎的改善中发挥非消极作用。A. muciniphila的一种代谢物—丙酸，可能发挥免疫调节功能。R. intestinalis通过减少结肠中的炎性巨噬细胞和活化的CD4+细胞并产生包括丁酸盐在内的短链脂肪酸，影响结肠运动、免疫维持和抗炎特性，从而改善IBD。由于不受控制的炎症是肌炎发病机制的特征，抗炎R. intestinalis的减少可能有助于肌炎的发展。肌炎与R. intestinalis或A. muciniphila之间的关系尚未被发现。作为益生菌的R. intestinalis和A. muciniphila在肌炎发展中的可能作用值得进一步研究。此外，本研究的根据结果得出，L. bacterium GAM79在HC中上调。然而，关于L. bacterium GAM79功能的研究尚未见报道。 总体而言，β多样性分析在ILD组和Non-ILD组之间没有观察到差异，由于本研究中分层后的样本量较小，结果可能受到限制。但在RP-ILD组和C-ILD组的比较中，发现RP-ILD组中B. thetaiotaomicron、P. distasonis和E. coli上调，B. A1C1和B. xylanisolvens下调。最近的一项研究证实，肌炎患者的氧化脂肪酸水平明显高于HC患者，尤其是合并ILD的肌炎患者。在本研究的结果中，肌炎相关RP-ILD组中P. distasonis还伴有葡萄糖和脂质代谢通路表达的降低，如糖原降解III，脂肪酸和β氧化V，这也表明P. distasonis可能通过下调葡萄糖和脂质代谢通路的表达来影响肌炎相关RP-ILD的发病过程。B. thetaiotaomicron、B. xylanisolvens和B. A1C1是拟杆菌属物种，它们在肠道内与宿主保持着复杂且有益的关系。B. thetaiotaomicron可刺激抗菌素Paneth细胞蛋白(Ang4)的产生，该蛋白可以杀死某些病原生物并诱导Paneth细胞产生一种杀菌凝集素RegIIIγ，它通过与革兰氏阳性生物的肽聚糖结合来发挥其抗菌作用。B. thetaiotaomicron还参与多种葡萄糖和脂质代谢通路。根据先前的研究，B. thetaiotaomicron似乎是益生菌，但本研究结果为B. thetaiotaomicron在与较高的死亡率相关的RP-ILD组中更为普遍，这表明B. thetaiotaomicron可能作为负反馈因子增加或在RP-ILD中发挥致病作用，其确切作用需要未来进一步研究。作为益生菌，B. xylanisolvens能够最终靠增加肠道叶酸水平和促进叶酸依赖性单碳代谢来缓解非酒精性肝脂肪变性和动脉粥样硬化。此外，它是1型糖尿病患者的常见物种。这些根据结果得出，在不同的背景和生长条件下，B. xylanisolvens可能发挥着复杂的作用，具有不一样的代谢特征并调节不同的信号通路。没有关于B. A1C1的研究，本研究结果为B. xylanisolvens和B. A1C1在RP-ILD组中均下调，这在某种程度上预示着它们可能是肌炎相关RP-ILD的益生菌。 本研究存在一些局限性。首先，由于肌炎的患病率较低，本研究难以实现大样本量。由于本研究比较的RP-ILD和C-ILD患者数量很小，因此有几率存在潜在影响结果的样本选择偏倚，作者将尝试增加样本量以便将来进一步验证和研究。为验证我们的研究，下载了有关数据作为本研究结论的外部验证。我们的宏基因组测序研究结果与先前的16S rDNA测序结果基本一致。这表明虽然本研究的样本量很小，但结果可能仍然是可靠的。第二个主要限制是，尽管肌炎具有家族遗传倾向，但我们没纳入患者的家族对照，未来需要进一步研究。此外，肠道微生物组最常见的外部干扰包括饮食和药物(尤其是抗生素)。抗生素的使用可导致肠道微生物群物种多样性减少和代谢活性改变。因此，本研究选择了未接受治疗的患者，排除了极端饮食和过去三个月内服用抗生素的患者。然而，有必要注意一下的是，即使短期使用抗生素，微生物群物种组成的变化可能会跟着时间推移持续存在。作为我们研究的局限性之一，我们没记录患者或健康对照是否在早期阶段使用过抗生素，这可能会给我们的分析带来不可预见的混杂因素。因此，我们将在未来的研究中记录更详细的药物或生活方式史，并分析其对患者微生物组的影响。此外，本研究还探讨了炎症标志物与微生物组之间的关系，如ESR、CRP、CK、肌炎相关自身抗体等。这些标志物是用于诊断IIM和评估肌炎患者炎症状态的常用临床指标。本研究的局限性之一是在设计研究时没有计划检查血浆中的促炎细胞因子、肠道通透性和微生物代谢物，也未收集适当的样本。我们将在未来的研究中进一步进行这些检测。最后，基于HUMAnN2分析结果，作者发现E. coli可能参与肌炎发病的多种生物学通路。然而，我们没办法通过生物学实验直接评估这些细菌的功能，包括E. coli在甲基膦酸酯降解I、dTDP-N-acetylthiosulfonamide生物合成和淀粉降解V通路中的贡献，这需要在之后的研究中进一步通过实验验证。

  本研究是第一项通过MWAS调查肠道微生物组在肌炎或肌炎相关ILD中的作用的研究。尽管肠道微生物组(例如P. distasonis和B. thetaiotaomicron)作用的生物学机制尚不清楚，但本研究的数据表明，这些微生物组在肌炎或肌炎相关ILD的发病机制中具有深远的影响。综上所述，本研究提供了许多与肌炎相关的细菌物种，它们代表了未来功能研究的潜在微生物靶点，以进一步阐明微生物组在肌炎病因学中的作用。